作科所揭示Cpf1介导的同源重组实现农作物基因替换的修复机制

     日前，中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴实验室与华中农业大学“人才项目专家”引进人才、美国加州大学圣地亚哥分校赵云德教授实验室合作，揭示了Cpf1介导的同源重组修复途径（homology-directed DNA repair, 简称HDR）实现农作物基因替换的修复机制，并在水稻中成功实现乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase, 简称ALS)基因的等位基因替换，获得抗除草剂水稻。相关研究论文在 Journal of Experimental Botany 杂志上于6月28日在线发表。

　　Cpf1蛋白最初发现于2015年，隶属于II类type V CRISPR系统，是比Cas9蛋白更小且更简单的核酸内切酶，具有组装简单、脱靶效率低等优点。不同于CRISPR/Cas9，CRISPR/Cpf1识别富含胸腺嘧啶“TTTV”的PAM序列，因此可实现对基因的5’和3’非翻译区进行编辑。CRISPR/Cpf1系统的发展扩大了基因组编辑技术的应用范围，为植物功能基因组研究和农作物改良提供了强有力的工具。但由于Cpf1的发现较晚和研发时间较短、相关技术体系尚不成熟等，目前还未有利用CRISPR/Cpf1介导的定点同源重组，实现重要农作物农艺性状改良的报道。

　　借助HDR途径实现目的基因替换和基因定点插入，进而创制农作物新种质是基因组编辑研究的重要课题之一。但由于植物细胞内HDR发生频率低，这在很大程度上阻碍了利用CRISPR/Cas系统对农作物基因进行精确编辑。CRISPR/Cpf1产生的DSBs具有5’突出端，其交错切割模式可能促进修复模板与基因组DNA的配对并使之插入基因组中，但其潜在修复机制仍需要进一步探究。本研究结果表明，当同源修复模板存在时，Cpf1产生的DNA双链切口（Double strand breaks, DSBs）经合成依赖性修复方式进行修复。利用此修复机制，我们将水稻中野生型ALS基因通过同源重组，进行等位基因替换，突变后的ALS基因携带有两个突变的氨基酸位点，从而赋予水稻植株除草剂抗性。进一步研究发现，当修复模板中只含有左侧同源臂时，同源替换事件仍可精确发生。此研究结果不仅在很大程度上简化了修复模板的设计，而且能够促进我们更好地理解HDR在植物中发生的潜在机制，进而为利用CRISPR/Cas基因组编辑技术，实现农作物基因的基因替换和定点整合等精准编辑研究提供了依据。

　　作科所博士研究生李少雅为本文第一作者，作科所夏兰琴研究员和华中农大赵云德教授为本文的共同通讯作者。本研究得到国家重点研发计划、转基因专项和中国农科院创新工程资助。

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